PRAKTIKUM ISOLASI DNA
A. TEORI
DASAR
Isolasi asam nukleat merupakan
tahap awal yang sangat menentukan dalam kerja teknologi gen.Ada bermacam tipe
sel yang memiliki perbedaan pada komposisi membrane sel, isi sel termasuk zat-zat
didalamnya dan juga jumlah zat nukleat yang tiap tiap objek perlu cara-cara
tertentu.telah banyak ditulis dalam sejumlah literature tentang metode
preparasi DNA . berikut ini disamapaikan protocol praktis untuk teknik-teknik
isolasi.
Dasar-dasar tahap kerja preparasi
asam nukleat adalah:
1. Pemecahan
atau lisis sel
Metode ini dilakukan dengan cara
mekanis melalui homogenasi dengan ditumbuk mortar dan pistil misalnya.
Homogenasi dengan N2 cair (materi sel dalam pendinginan tinggi)
merupakan suatu homogenasi efektif.Buffer untuk homogenasi harus dalam keadaan
stabil pH-nya dan setelah lisis dapat berkaitan dengan materi (isis sel).
Melalui pemberian ikatan kompleks akan terjadi ikatan kaiton biovalen dimana
hala ini berperan sebagai kofaktor nuclease.
2. Sentrigugasi
dan filtrasi
Homogen hasil lisis dipisahkan
melalui sentrifugasi dan filtrasi dari makromolekul yang merupakan komponen sel
yang tidak dapat larut.Setelah tahap ini tersedia suatu lisat yang bersih.
3. Deproteinisasi
Pelarutan protein dilakukian dengan
melalui pengocokan lisat bersih dengan fenolatau campuran fenol-kloroform
murni. Pemisahan fase ini dapat dilanjutkan dengan sentrifugasi. Efesiensi
deproteinasasi dapat dinaikkan melalui inkubasi lisat dengan protease.
4. Prespitasi
Prespitasi asam nukleat dapat dicapai dengan melalui
penambahan ethanol (ethanol, isopropanol). Efisiensi prepitasi dapat
ditingkatkan dengan pendinginan. Prespitasi diendapkan melalui sentrifugasi dan
dilarutkan pada konsentrasi tertentu dari buffer yang dikehendaki.
5. Pemurnian
Jika perlu, asam nukleat dapat
dimurnikan dengan sentrifugasi bertahap seperti kromatografi. Pemisahan DNA/RNA
dari campuran asma nukleat dapat dicapai melalui incubasi dengan enzim nuclease
yang sesuai (RNAse atau DNAse).
Teknik diatas adalah prosedur dasar
yang harus dilalui untuk mendapatkan ekstrak DNA biasanya masih belum
murni (crude material ) yang masih
tercampur dengan materi protein.
B. TUJUAN
Mempelajari cara isolasi DNA dengan teknik sedehana
C. ALAT
DAN BAHAN
1. Mortar 10 Alkhohol 95% dingin
2. Sendok
kecil 11. Kain kasa/kain saring
3. Pistil 12. Tabung reaksi
4. Rak
tabung reaksi 13. Breaker glass 250 ml
5. Gelas
ukur 14.
Pipet
6. Pisau 15.
Pengaduk
7. NaCI 16.
Detergen
8. Akuades
9. Berbagai
macam buah masak dan lunat
D. CARA
KERJA
Isolasi DNA dari bahan buah-buahan:
1) Kita
Menguliti buah lunak (papaya,
mangga, kiwi, dan potong-potongan).kemudian dengan garbu membuat menjadi bubur
buah didalam beaker glass plastic 250 ml.
2) Kita
Menambahkan bahan ini dengan 3 g NaCI,10 ml detergen dan kita buat volume
hingga 100 ml dengan menambahkan air
3) Bahan
ini kita aduk sampai rata di campur dengan garbu atau pengaduk kemudian kita
saring dengan saringan dan tampung hasil
penyaringan ini.
4) Kemudian
biarkan bahan hasil saringan ini untuk beberapa menit kemudian ambil 6 ml an
kita massukkan ke dalam tabung reaksi/uji.
5) Kita
mengalirkan 9 ml etanol dingin pada sisi tabung dan tunggu beberapa menit untuk
terjadi prespitasi DNA dan kemudian akan munvul pada permukaan etanol seperti
masa putih berupa benang-benang jika memang benar prosedurnya.
6) Kemudian
benang-benang ini dapat dipindah dengan alat/stik atau pastete dari cianol.
E. ANALISIS
Pada pengamatan yang di lakukan, kami
menggunakan medium buah pisang yang kemudian di lumatkan untuk mengambil
sarinya. Setelah itu di gunakan deterjen cair (sunlight) dan detergen bubuk
(rinso) sebagai uji. Dari situ kita dapat melihat bahwa sari buah pisang yang
di tambahkan deterjen cair (sunlight) mengalami presipitasi DNA dan kemudian
muncul permukaan etanol seperti masa putih berupa benang-benang halus.
Sedangkan pada medium sari buah pisang yangdi tambahkan deterjen bubuk (rinso)
tidak mengalami presipitasi DNA.
F. DISKUSI
1. Mengapa
dalam isolasi harus didahului dengan menumbuk atau menghancurkan sel?
Jawab:
Selain
untuk mengambil sari-sari dari buah tersebut juga untuk mempermudah pengikatan materi
(isi sel) yang berperan sebagai kofaktor nucleus.
2. Apa
fungsi penggunaan detergen dan NaCl dalam isolasi DNA?
Jawab:
Deterjen Berfungsi untuk
melisiskan barier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia
yang mampu merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang dapat
mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil
endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+
yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta
menghambat enzim-enzim seluler ynag dapat merusak DNA (ion Mg2+
merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa "memakan" DNA).
Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi lipid dan
protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena
detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang
sama dengan dodesil sulfat.
Garam (NaCl) memegang
peranan penting yaitu untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam
dapat mnyebabkan keduanya terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergen,
keduanya berfungsi sepertihalnya lysing buffer.
Garam juga digunakan untuk
melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir
(membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa
menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada
saat ion Na+ membentuk ikatan denagn kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul.
Jadi nampak bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat
dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan
DNA.
3.
Apa kegunaan alkohol dalam praktikum saudara?
Jawab:
Alkohol berfungsi untuk pengikatan strand DNA yang telah terkumpul kerena
pemekatan oleh garam, karena kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan
kerapatan air maka alkohol akan berada di bagian atas larutan pada tabung
reaksi. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagi
benang-benang putih yang terapung di atas filtrat.
G. KESIMPULAN
Dalam
pengamatan yang telah di lakukan dapat di simpulkan bahwa:
Dalam pengamatan penumbukan di gunakan untuk mengambil sari-sari dari buah dan
juga untuk mempermudah pengikatan materi (isi sel) yang berperan sebagai
kofaktor nucleus. Sedangkan untuk penggunaaan detergen,Untuk melisiskan
barier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia. NaCl
untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat mnyebabkan
keduanya terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi
sepertihalnya lysing buffer. Dan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+
yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub
negatif fosfat DNA. Sedangkan penambahan Alkohol berfungsi untuk pengikatan
strand DNA yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam
H. DAFTAR
RUJUKAN
http://anggieanalis03.blogspot.com/2010/12/ isolasi-dna.html